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渔业研究, 2023, 45(2): 182-191 DOI: 10.14012/i.cnki.fjsc.2023.02.011

综述与其他

微藻育种方法研究进展

周琳琳,1,2, 郭辰涛1,3, 钟晨辉1,3, 林琪,1,3,*

1.福建省水产研究所,福建省海洋生物增养殖与高值化利用重点实验室,福建 厦门 361013

2.上海海洋大学,水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室,上海 201306

3.海洋生物种业技术国家地方联合工程研究中心,福建 厦门 361013

Research advanced of breeding methods on microalgae

ZHOU Linlin,1,2, GUO Chentao1,3, ZHONG Chenhui1,3, LIN Qi,1,3,*

1. Key Laboratory of Cultivation and High-value Utilization of Marine Organisms in Fujian Province,Fisheries Research Institute of Fujian, Xiamen 361013, China

2. Key Laboratory for Exploitation and Utilization of Aquatic Germplasm Resources, Ministry of Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China

3. National and Local Joint Engineering Research Center for Marine Biological Seed Industry Technology, Xiamen 361013, China

通讯作者: 林 琪(1970―),男,研究员,硕士生导师,博士,研究方向为海洋生物。E-mail:xmqlin@sina.com

收稿日期: 2022-11-29  

基金资助: 现代农业产业技术体系专项(CARS-50)

Received: 2022-11-29  

作者简介 About authors

周琳琳(1998―),女,硕士研究生,研究方向为藻类遗传育种。E-mail:1342335070@qq.com

摘要

微藻作为单细胞光合自养真核植物,因具有生长速度快、光合效率高等特点,在医药、农业、能源等方面发挥着重要的作用。筛选具备油脂含量高、生长速度快、抗逆性强等优势的藻株对于促进产业的发展具有重要意义。本文综述了目前利用物理方法、化学方法和分子育种技术在微藻育种的研究成果,分析了不同育种方法存在的问题以及相关的解决方案,为推动微藻育种的发展提供一定的参考。

关键词: 微藻; 诱变育种; 物理诱变; 化学诱变; 分子育种

Abstract

Microalgae is a kind of unicellular photosynthetic autotrophic eukaryotic plant, which grows rapidly and processes high photosynthetic efficiency.It can provide a lot of high value products, such as protein, polyunsaturated fatty acids and bioactive compounds which are important sources of health care, aquaculture and biofuels.In order to improve productivity, microalgae breeding technology has been developed to explore the strains which have larger biomass, more lipid, and the ability of stress resistance.The article summarized the advantages and disadvantages of various breeding technologies and research advanced, in order to provide a reference for the development of microalgae breeding.

Keywords: microalgae; mutation breeding; physical mutagenesis; chemical mutagenesis; molecular breeding

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本文引用格式

周琳琳, 郭辰涛, 钟晨辉, 林琪. 微藻育种方法研究进展[J]. 渔业研究, 2023, 45(2): 182-191 DOI:10.14012/i.cnki.fjsc.2023.02.011

ZHOU Linlin, GUO Chentao, ZHONG Chenhui, LIN Qi. Research advanced of breeding methods on microalgae[J]. Journal of Fujian Fisheries, 2023, 45(2): 182-191 DOI:10.14012/i.cnki.fjsc.2023.02.011

微藻是一类光合效率高、生长速度快的自养型生物,细胞结构为单细胞,通常以二分裂方式增殖,且细胞周期短,具有易培养、适应性强等特点[1-2]。微藻可以利用简单的元素合成具有独特结构和生理功能的生物活性物质,在人类生产与生活中,引起了广泛的关注[3]。作为初级生产者,微藻不仅能将无机环境中的物质能量同化吸收,促进生态系统元素循环,同时还能伴随产生油脂、蛋白质、多糖、不饱和脂肪酸等多种活性物质[4-5]。基于微藻自身的特点,其产业应用广泛分布在生产生活的各个领域中。在农业方面,因含有丰富的营养物质,微藻常作为鱼类、贝类的优质饲料[6]。在生态环境方面,微藻能够利用水中的有机物,包括碳、氮、磷等,并释放溶解氧到水体中,因此其也常被用于废水处理,包括生活废水、工业废水、养殖废水[7]。同样,微藻在生物能源及食品药品等领域也备受关注。由于化石燃料的局限性,微藻作为第三、第四代生物燃料的生产生物已成为当下的一个研究热门,小球藻[8]、微拟球藻[9]在生物柴油制备方面应用较多。在食品药品方面,螺旋藻[10-11]、裂殖壶藻[12]、雨生红球藻[13]等含有的生物活性物质也常被用于开发食品、药品和保健品等。

微藻的育种经历了漫长的发展过程,最早可以追溯到1957年的称重法,这是自然分离选育的一种方法,Moazami N等[14]用此方法筛选得到了2株高油脂含量的微藻。自然分离选育还包括平板划线法、稀释法、微吸管法和 96 孔板法等。但是传统自然选育周期长,同时伴随着选育品质性状不稳定、生物质产量低等缺点,限制了微藻产业发展[15],因此将一些新兴的技术手段用于微藻种质资源的创新,对微藻产业发展具有深远的意义。本文综述了不同方法在微藻育种领域的研究成果,并分析了其存在的优势和不足,以期为后续的微藻产业发展研究提供参考。

1 微藻育种的应用

微藻虽然含有许多高附加值的产品,如油脂、二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid,EPA)、二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA)、虾青素等,但原始藻株的生产能力有限,因此提高微藻的油脂含量、生长速度、光合作用效率等性状对于推动微藻产业的发展是十分必要的。随着育种技术应用于微藻,目前已经选育出许多性状优良的突变藻株,并且被广泛应用在生产和生活中。

1.1 水产饲料

微藻含有丰富的蛋白质、脂肪、碳水化合物等营养元素以及各类生物活性物质,可以满足水产动物的营养需求,能有效促进水产动物的生长发育,提高抗逆能力[16] 。但微藻生物量、生长速度、环境适应能力等都存在局限性,因此选育出生物量高、生长速度快、环境适应性强的藻株成为了饲料微藻的选育目标之一。已有相关研究报道,如夏金兰等[17]通过紫外线诱变小球藻获得了1株耐高温的突变藻株,这使小球藻最适生长温度提高到了35℃;Ong S C等[18]通过甲基磺酸乙酯(Ethyl methanesulfonate,EMS)溶液诱变小球藻,使小球藻的生长温度提高到了40℃。

1.2 修复水环境

近年来,随着“绿色水产养殖”理念的提出,日益突出的环境问题也被提上了议程。作为微生物一类,微藻被认为是天然的净化者[19],自1957年,利用微藻去除水体中的氮、磷等营养盐这一观点被Oswald W J等[20]提出来之后,有研究发现,小球藻对水体中氮和磷的去除率分别可达86%和78%[21-22],此外,Rugnini L等[23]利用小球藻和链带藻去除水介质中重金属Cu和Ni,在混合金属溶液中的去除率分别达到了95%和90%。

1.3 碳中和

随着工业技术的发展,二氧化碳的排放量逐年增加,对自然环境造成了严重的影响[24]。微藻通过光合作用,可以将大气中CO2转化为有机物,从而实现碳中和。越来越多的科学家发现,藻类的CO2固定率大约为12%,利用藻类捕获和固定环境中的CO2是一种安全有效的方式[25],因此提高CO2的固定率成为微藻育种的目的之一。Zhu Y等[26]采用60Co-γ射线诱变钝顶螺旋藻获得的突变株对CO2的固定率提高了22.4%;Yang B等[27]通过过表达小球藻的果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(Fructose-1,6-bisphosphate aldolase,FBA),使得细胞固定二氧化碳的效率提高了24.7%。

1.4 生物柴油

生物柴油作为一种清洁能源越来越受到人们的重视。微藻能够在有机物和CO2存在的情况下生产脂质,并且微藻细胞产生的脂质的性质与柴油相似,因此可以将微藻用于生物柴油的制备[28]。但由于微藻细胞个体小,油脂含量低,以小球藻为例,小球藻细胞大小为3~8 μm,油脂含量占细胞干重的20%[29],相对于人类的生产活动是远远不够的,因此培育出高油脂含量的藻株是微藻育种的主要目标之一。尽管通过藻类制备生物柴油还处于初级阶段,同时生产成本高昂,导致其无法与化石能源竞争,但微藻生物柴油仍然是未来生物能源主要的来源之一[30]

1.5 活性物质

微藻中含有的生物活性物质也常被添加于食品、保健品、药品等产品中。微藻中含有的不饱和脂肪酸,主要包括EPA和 DHA。其中,EPA可以调节血脂,保护心脑血管,常用作为老年人保健品的重要添加物;DHA除了有保护心脑血管的作用,还是大脑成长,发育的重要物质,常被用于婴幼儿食品[31-32]。螺旋藻含有丰富的蛋白质、多糖、维生素等,具有提高人体免疫力、抗衰老等作用[10],因此也常被用于保健品。虾青素作为一种抗氧化剂,也用来作为食品、保健品以及生物饲料的重要添加物。雨生红球藻中虾青素的含量为1.5%~10.0%,被称为天然虾青素的“浓缩品”,因此雨生红球藻已成为提取虾青素的主要微藻[33-34]

2 微藻育种方法

目前,常见的微藻育种方法主要包括2种:诱变育种和新兴的分子育种。诱变育种是指通过物理、化学或者二者相结合的方式处理藻细胞,造成遗传物质发生改变,再通过定向的筛选、培育,来获得目的性状优良的目标藻株[35]。分子育种是指将分子生物学技术应用于育种,主要在分子水平上对基因进行改造,从而改变性状。分子育种能够定向地控制基因表达,它可以实现微藻育种的定点突变,弥补诱变育种的不定向性[16]

2.1 物理诱变

物理诱变主要用α射线、β射线、中子和其他粒子、紫外辐射以及微波辐射等物理因素诱发变异,引起分子结构改变,诱发染色体异位、缺失、重组或断裂等,从而引起后代性状产生变异[36]。常用的物理诱变主要包括紫外线(Ultraviolet ray,UV)、射线、重离子束(Linear energy transfer,LET)、常压室温等离子体(Atmospheric and room temperature plasma,ARTP)、激光、超声波和太空射线[35]

2.1.1 紫外诱变

紫外诱变是通过UV照射藻类细胞DNA,导致藻细胞DNA双链双螺旋结构变异,碱基错配,从而形成突变体[15]。紫外诱变操作简便易上手,因此其在微藻诱变中被广泛应用。

通过UV照射藻细胞时,功率范围一般为10~30 W、照射距离为10~40 cm、辐射时间选取在30~900 s之间,并且在致死率为80%~95%的范围内选取突变株。目前,通过紫外诱变已经选育出油脂含量高、DHA含量高的微藻[12,37-39],具体情况见表1

表1   紫外诱变在微藻育种中的研究成果

Tab.1  Research results of UV mutagenesis in microalgae breeding

微藻种类
Microalgae species
目标产物
Target products
诱变条件
Mutation condition
诱变结果
Results
参考文献
References
小球藻
Chlorella
vulgaris
油脂功率18 W、
照射距离40 cm、
辐射时间5~40 min
油脂含量提高了24.6%[37]
裂壶菌藻
Scizochytrium
limacinum
DHA功率30 W、
照射距离30 cm、
照射时间10~ 60 s
DHA含量提高28.8%,
占脂肪酸的37.3%
[12]
三角褐指藻
Phaeodactylum
tricornutm
EPA功率18 W、
照射距离35 cm、
照射时间5~30 min
诱变株UP1的EPA含量
提高了10.2%
[38]
若夫小球藻
Chlorella
zofingensis
油脂功率20 W、
照射距离20 cm、
照射时间15~40 min
总油脂产量达2.4 g/L,
提高了50.0%
[39]

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2.1.2 射线诱变

射线包括X射线、γ射线、α射线、β射线等,是一种能量高、穿透力强的电离辐射源。射线诱变是指辐射造成DNA分子共价键断裂或者分子缺失,当修复出错时造成突变,进而获得突变体[40]。γ射线相对于其他射线具有更强的穿透力,可诱变藻株产生多种活性代谢物,如酶和维生素等[41-42]。目前在微藻的育种中多使用 60Co-γ诱变原始藻株,射线的诱变剂量一般为100~1 600 Gy,获得的突变株的油脂含量有较大幅度的提高[43-45],具体见表2

表2   60Co-γ射线诱变选育高油脂藻株研究成果

Tab.2  Results of 60Co-γ ray mutagenesis and breeding of high lipid algae

微藻种类
Microalgae species
目标产物
Target products
诱变条件
Mutation condition
诱变结果
Results
参考文献
References
寇氏隐甲藻
Crypthecodinium
cohnii
油脂诱变剂量: 0.8~2.4 kGy油脂产量提高51.7%[43]
栅藻
Scenedesmus sp.
油脂诱变剂量: 50 Gy~3 kGy油脂含量提高60.0%[44]
小球藻
Chlorella sp.
油脂诱变剂量: 300~900 Gy油脂含量提高54.9%[45]

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2.1.3 重离子束诱变

离子辐射源包括质子、氦和带正电的重离子等,长期以来被用作微生物和植物育种的诱变剂[46]。其中使用较多的是重离子,而LET是指被剥掉或部分剥掉外围电子后的带正电的原子核通过大型加速器装置加速而形成的具有能量的射线。相较于传统的诱变源,LET具有传能线密度大、相对生物学效应高、损伤后修复效应小、能量沉积的空间分辨性好等生物学优势[47]。目前,诱变实验中使用较多的LET主要是碳离子束,使用的碳离子的能量为80 MeV/μ,密度为31 keV/μm,诱变剂量通常在10~160 Gy之间,并且获得了性状优良的藻株[9,48-50],具体见表3

表3   重离子束诱变育种的研究成果

Tab.3  Research results of heavy ion beam mutagenesis breeding

微藻种类
Microalgae species
目标产物
Target products
诱变条件
Mutation condition
诱变结果
Results
参考文献
References
微拟球藻
Nannochloropsis
oceanica
油脂能量80 MeV/μ、
密度31 keV/μm、
诱变剂量20~160 Gy
油脂产量提高28.0%[48]
微拟球藻
Nannochloropsis
oceanica
油脂能量80 MeV/μ、
密度31 keV/μm、
诱变剂量20~160 Gy
诱变株油脂产量提高19.0%[9]
极大螺旋藻
Spirulina maxima
生物量能量80 MeV/μ、
密度31 keV/μm、
诱变剂量200~1 000 Gy
生物量达到0.9 g/L,
提高了12.6%
[49]
盐生杜氏藻
Dunaliella salina
生物量能量80 MeV/μ、
密度33 keV/μm、
诱变剂量30~320 Gy
生物量提高了1.8倍[50]

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2.1.4 常压室温等离子体诱变

ARTP 诱变是通过释放活性粒子, 作用于微生物的细胞壁或细胞膜, 使其结构和通透性发生变化,引起基因损伤,致使突变,从而获得性状优良的藻株。相较于其他诱变方法,ARTP诱变具有高效、稳定、无毒、环保、成本低等优点[51]

采用ARTP诱变时,一般是在功率为80~120 W、通气量为10 ~12 SLM、距离为2~5 mm的条件下进行的,诱变时间选取在10~150 s之间。利用ARTP选育出的突变株性状优良,表现在油脂含量高、虾青素含量高等[52-55],具体见表4

表4   ARTP在微藻育种中的研究成果

Tab.4  Research results of ARTP in microalgae breeding

微藻种类
Microalgae species
目标产物
Target products
诱变条件
Mutation condition
诱变结果
Results
参考文献
References
湛江等鞭金藻
Isochrysis
zhangjiangensis
油脂功率100 W、
通气量10 SLM、
距离2 mm、
诱变时间10~30 s
油脂产率提高17.9%[52]
雨生红球藻
Haematococcu
pluvialis
虾青素功率100 W、
通气量10 SLM、
距离2 mm、
诱变时间10~60 s
虾青素含量提高52.0%[53]
小球藻
Chlorella sp.
油脂功率100 W、
通气量12 SLM、
距离5 mm、
诱变时间30~80 s

突变株产油量达到0.07 g/mL,
单位鲜菌体产油量为23.2%
[54]
裂殖壶藻
Schizochytrium
limacinum
DHA功率120 W、
气流量10 SLM、
距离2 mm、
诱变时间5~35 s
DHA含量和产量分别提高了
74.6%和61.2%
[55]

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2.2 化学诱变

化学诱变是指使用一些导致基因突变的化学诱变剂,使遗传物质发生突变,从而获得性状优良的突变株。在生物育种中,化学诱变对于获得优良性状的诱变体是一个高效且简单的方法,这是因为化学诱变能够在DNA非致死点反复诱变,由此可产生稳定的遗传物质[56-57]。目前常用的化学诱变剂主要是烷化剂,包括EMS、亚硝基胍(Nitrosoguanidine,NTG)、硫酸二乙酯(Diethylsulfate,DES)等。化学诱变对基因的损害较小,具有特异性,并且具有操作简单、成本低、突变范围广等优点,在诱变育种中被广泛使用。近年来,化学诱变在寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、雨生红球藻(Haematococcu pluvialis)、栅藻(Desmodesmus sp.)等均获得突变株[56-59]

使用化学诱变剂诱变微藻时,采用较多的方法是在固定的时间内,采用不同浓度的诱变剂[58-61]进行实验,这有利于缩短实验时长。如NTG诱变微藻,NTG的浓度范围一般在1~5 g/mL之间,诱变时间通常设定为10~60 min。具体见表5

表5   不同化学试剂诱变微藻研究成果

Tab.5  Research results of mutagenesis of microalgae by different chemical reagents

微藻种类
Microalgae species
目标产物
Target products
诱变条件
Mutation condition
诱变结果
Results
参考文献
References
寇氏隐甲藻
Crypthecodinium
cohnii
DHANTG浓度50 ~250 μg/mL、
时间30 min
突变株DHA含量
提高了121.6%
[58]
莱茵衣藻
Chlamydomonas
reinhardtii
TAGEMS浓度300 mmol/L、
时间80 min
TAG含量提高3.4倍[59]
雨生红球藻
Haematococcu
pluvialis
虾青素NTG浓度0.5 ~3.5 g/L、
时间30 min
虾青素含量达到
(2.9±0.3)mg/L
[60]
栅藻
Desmodesmus sp.
生物量EMS浓度0.6 ~0.9 mol/L、
时间60 min
生物质产量提高45.5%[61]

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2.3 分子育种

分子育种,是一种新兴的手段,包括基因工程育种和基因编辑育种。基因工程育种,也被称为转基因育种,是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内,使之能在受体细胞内复制、转录、翻译和表达,以改变生物原有的遗传特性获得新品种。当前,外源基因导入细胞内的技术主要包括电转法、微粒轰击法(基因枪法)、农杆菌介导转化法、玻璃珠搅拌法、自然转化法、细菌接合法和脂质体转化法[62]。近年来,Crispr/cas9等基因编辑育种技术也逐渐被应用于微藻[63],与基因工程育种不同的是,基因编辑是对特定基因进行修饰,没有外源基因的导入。这2种新兴的育种方式具有针对性强、稳定性强的特点,能够通过定向改造遗传物质获得较理想的突变藻株[15]

相对于传统的育种技术,新兴的微藻育种还处于初级阶段。三角褐指藻作为模式生物,无论是基因工程,还是基因编辑技术,都有广泛的应用,在微藻育种中的主要目标产物为脂质、甘油三酯(Triacylglycerol,TAG)等[63-67],具体见表6

表6   分子育种在微藻育种中的研究成果

Tab.6  Research results of molecular breeding in microalgae breeding

微藻种类
Microalgae species
目标产物
Target products
育种方法
Breeding method
结果
Results
参考文献
References
三角褐指藻
Phaeodactylum
tricornutum
脂质基因工程育种:
外源克隆DGTA2基因,
电转法过表达DGTA2
中性脂质含量增加了2倍[64]
TAG基因工程育种:
外源克隆AGPAT1基因,
电转法过表达AGPAT1
TAG含量增加了1.81倍[65]
脂质基因工程育种:
外源克隆DGAT2-
2A-GPAT基因,
电转法过表达DGAT2和GPAT
脂质含量增加了2.6倍[66]
TAG基因编辑育种:
TALEN的基因编辑技术
破坏乙酰辅酶A
水解酶(ptTES1)表达
TAG含量提高了1.7倍[67]
EPA基因编辑育种:
Criper/cas9的基因编辑技术
敲除PtLPCAT1基因
突变株EPA含量占到
总脂肪酸含量的30%
[63]

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3 微藻育种存在的问题及解决方法

虽然微藻育种技术已经发展多年,但微藻育种仍然处于一个发展阶段,并存在以下几个问题:1)产量和品质互相矛盾。在藻类育种的过程中,筛选得到生产率高、性状优良的品种是最理想的结果。但实际情况中,产量和品质却很少能同时提高,研究发现这可能是控制品质和产量的基因是相互连锁的,提高一种性状的基因表达会影响其他基因的表达,很难一起提高,甚至产生抑制作用,这是因为微藻是单细胞生物,其繁殖体系使基因间的连锁难以打破[68]。2)诱变因子及诱变剂量难以精确控制。不同种类微藻诱变因子和诱变剂量是不同的,因此在育种时如何选择诱变因子及诱变剂量是目前诱变育种的一大难题。研究发现,同一种类的微藻,不同的诱变因子均能筛选出性状优良的藻株。尤其是化学试剂的诱变剂量更加难以确定,化学诱变剂处理强度的衡量通常用暴露剂量,而不是吸收剂量,因为吸收剂量一般情况下无法确定,但对遗传物质产生作用的却是吸收剂量,因此化学诱变中化学物质的诱变剂量通常是一个估计值[69]。3)筛选难度大。诱变后的藻株样本容量较大,但并非所有的诱变株都是符合诱变目的的藻株,因此需要对诱变后的藻株进行筛选,以获得所需的藻株。另外,筛选出的藻株还需要连续培养几代,确保遗传物质能够稳定遗传。筛选出性状优良的藻株是一个费时费力的过程。

针对微藻育种技术存在的问题,可以从以下两个方面解决:一方面,研究人员需要熟悉不同藻种的生理特性,选择最适合的育种方法,或者还可以通过物理诱变和化学诱变相结合即复合诱变方法,从而选育出最佳的藻株;另一方面,微藻诱变育种与当前先进的基因工程相结合,如可以通过基因组重测序技术、转录组测序、蛋白质组分析等技术,从DNA、蛋白水平上揭示表型与基因型之间的联系,掌握诱变作用机理,从而实现高效、定向诱变育种。

4 展望

不同的诱变方法有各自的优劣势。物理诱变方法操作简单、易上手,也是目前使用最为广泛的方法,但其设备要求高,前期投入成本较大;化学诱变方法弥补了物理诱变投入成本过高的不足,但化学试剂可能具有毒性,这加大了实验操作的风险;基因工程育种相对前两种方法,克服了诱变方向的随机性,实现了定点诱变,但我国目前与基因工程育种相关的实验做得相对较少,技术相对不成熟,并且基因工程目前还存在争议,因此还需要进一步研究。

尽管我国微藻诱变育种仍处于初级阶段,但近年来研究者们利用诱变方法仍然培育出了许多含油量高、生长速率快、生物量高的藻株,这为未来优化选育技术和提高藻株性状奠定了坚实的基础。此外,可将微藻育种与实际生产结合起来,根据实际需求动态地调整目标,促进微藻的可持续发展。通过诱变方法选育性状优良的藻株,提高微藻自身含有的天然高附加值产物含量,推动微藻育种的高效发展,为微藻产业链带来巨大的经济效益和社会效益。

参考文献

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Microalgal carbohydrates: an overview of the factors influencing carbohydrates production, and of main bioconversion technologies for production of biofuels

[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2012, 96(3): 631-645.

DOI      PMID      [本文引用: 1]

Microalgal biomass seems to be a promising feedstock for biofuel generation. Microalgae have relative high photosynthetic efficiencies, high growth rates, and some species can thrive in brackish water or seawater and wastewater from the food- and agro-industrial sector. Today, the main interest in research is the cultivation of microalgae for lipids production to generate biodiesel. However, there are several other biological or thermochemical conversion technologies, in which microalgal biomass could be used as substrate. However, the high protein content or the low carbohydrate content of the majority of the microalgal species might be a constraint for their possible use in these technologies. Moreover, in the majority of biomass conversion technologies, carbohydrates are the main substrate for production of biofuels. Nevertheless, microalgae biomass composition could be manipulated by several cultivation techniques, such as nutrient starvation or other stressed environmental conditions, which cause the microalgae to accumulate carbohydrates. This paper attempts to give a general overview of techniques that can be used for increasing the microalgal biomass carbohydrate content. In addition, biomass conversion technologies, related to the conversion of carbohydrates into biofuels are discussed.

周玉娇, 李亚军, 费小雯, .

小球藻紫外线诱变及高含油藻株筛选

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王芝瑶. 重离子诱变创制高光效高产油微拟球藻新品种[D]. 广州: 暨南大学, 2013.

[本文引用: 3]

Angelina M, Margareth S K, Charles V L.

Biomass and nutritive value of Spirulina(Arthrospira fusiformis)cultivated in a cost-effective medium

[J]. Annals of Microbiology, 2019, 69(13): 1387-1395.

DOI      [本文引用: 2]

Introduction Cultivation of spirulina at commercial-scales relies on analytical grade-based media, which are expensive and so are the product. Purpose This study assessed the biomass, proximate composition, and other useful compounds in Spirulina (Arthrospira fusiformis) produced with a cost-effective culture medium (LCMA), and the results were compared with those from a standard Zarrouk medium-grown spirulina. Methods The LCMA medium was formulated by using a commercial NPK10-20-20 fertilizer as a source of the three major nutrients for spirulina growth, and other three ingredients from Zarrouk medium. The experiment was conducted for 28 days in the glass aquaria under indoor conditions. Standard analytical methods were applied for the determination of proximate composition, chlorophyll, minerals, and vitamins in the spirulina biomass. Result The LCMA medium showed the best growth conditions by accumulating higher chlorophyll content (0.99 +/- 0.02%) and dry weight (0.75 +/- 0.01 g/100 ml) as well as attaining higher optical density (2.06 at day 15) earlier than the Zarrouk medium. The results of the proximate analysis for spirulina cultured in the LCMA medium were of good quality, with the protein contributing more than 50% of its dry matter. It was further noticed that the LCMA was an ideal medium for optimization of vitamins and some minerals since it recorded a significant amount of most of the analyzed vitamins together with the minerals sodium and potassium compared with the Zarrouk medium. Conclusion It is suggested that LCMA medium could be used as the alternative and cheap medium for maximization of biomass and production of useful biochemical compounds in spirulina species.

Deasy L, Indah R, Rugaiyah A A, et al.

Nutritional analysis of Spirulina sp.to promote as superfood candidate

[J]. IOP Conference Series:Materials Science and Engineering, 2019, 509(1): 227-232.

[本文引用: 1]

许永, 臧晓南, 徐涤, .

裂殖壶菌诱变筛选的研究

[J]. 中国海洋大学学报(自然科学版), 2012, 42(12): 54-58.

[本文引用: 3]

Di S G, Mehariya S, Martino M, et al.

Supercritial carbon dioxide extraction of astaxanthin, lutein, and fatty acids from Haematococcus pluvialis microalgae

[J]. Marine Drugs, 2018, 16(9): 334.

DOI      URL     [本文引用: 1]

Haematococcus pluvialis microalgae in the red phase can produce significant amounts of astaxanthin, lutein, and fatty acids (FAs), which are valuable antioxidants in nutraceutics and cosmetics. Extraction of astaxanthin, lutein, and FAs from disrupted biomass of the H. pluvialis red phase using carbon dioxide (CO2) in supercritical fluid extraction (SFE) conditions was investigated using a bench-scale reactor in a semi-batch configuration. In particular, the effect of extraction time (20, 40, 60, 80, and 120 min), CO2 flow rate (3.62 and 14.48 g/min) temperature (50, 65, and 80 °C), and pressure (100, 400, and 550 bar.) was explored. The results show the maximum recovery of astaxanthin and lutein achieved were 98.6% and 52.3%, respectively, at 50 °C and 550 bars, while the maximum recovery of FAs attained was 93.2% at 65 °C and 550 bars.

Moazami N, Ranjbar R, Ashoria A, et al.

Biomass and lipid productivities of marine microalgae isolated from the Persian Gulf and the Qeshm Island

[J]. Biomass and Bioenergy, 2011, 35(5): 1935-1939.

DOI      URL     [本文引用: 1]

付峰, 隋正红, 孙利芹, .

藻类诱变育种技术研究进展

[J]. 生物技术通报, 2018, 34(10):58-63.

DOI      [本文引用: 3]

藻类诱变育种技术是指利用物理和化学因素诱发藻体产生遗传变异,在短时期内获得有价值的突变体的育种方法。藻类是水生生态系统中主要的初级生产者,与人类生活及经济发展有着密切的关系,是发展“蓝色农业”的基础。诱变育种已经成为提高藻类育种效率,获得新种质的一个重要手段,广泛应用在生物活性物质含量高的微藻、生物能源微藻及一些大型的经济海藻中。在藻类育种中常用的诱变技术主要包括物理和化学诱变技术。物理诱变辐射源包括紫外线、γ射线、重离子束及常压室温等离子体等,化学诱变剂主要包括甲基磺酸乙酯和亚硝基胍等。主要介绍了上述诱变技术的诱变机理和生物学效应,总结了诱变技术在藻类育种中的研究进展及应用前景,以期推动藻类诱变育种的发展。

单晓慧, 王瑶, 赵东升.

微藻育种的研究进展

[J]. 现代农业科技, 2020(16):142-143,147.

[本文引用: 2]

夏金兰, 宁进军, 陈程浩, .

耐高温小球藻紫外诱变育种及其耐高温性质研究

[J]. 中南大学学报(自然科学版), 2013, 44(3):867-873.

[本文引用: 1]

Ong S C, Kao C Y, Chiu S Y, et al.

Characterization of the thermal-tolerant mutants of Chlorella sp.with high growth rate and application in outdoor photobioreactor cultivation

[J]. Bioresource Technology, 2010, 101(8): 2880-2883.

DOI      URL     [本文引用: 1]

杜勇, 杜雨润, 朱绍萍, .

微藻在环境修复中的研究进展

[J]. 环境科学与技术, 2014, 37(S2):316-320.

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Oswald W J, Gotaas H B.

Photosynthesis in sewage treatment

[J]. Transactions of the American Society of Civil Engineers, 1957, 122: 73-105.

DOI      URL     [本文引用: 1]

吕福荣, 杨海波, 李英敏, .

自养条件下小球藻净化氮磷能力的研究

[J]. 生物技术, 2003(6):46-47.

[本文引用: 1]

Shi J, Podola B, Melkonian M.

Removal of nitrogen and phosphorus from wastewater using microalgae immobilized on twin layers:an experimental study

[J]. Journal of Applied Phycology, 2007, 19(5): 417-423.

DOI      URL     [本文引用: 1]

Rugnini L, Gosta G, Congestri R, et al.

Testing of two different strains of green microalgae for Cu and Ni removal from aqueous media

[J]. Science of the Total Environment, 2017, 601-602: 959-967.

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Li S, Li X, Ho S H.

How to enhance carbon capture by evolution of microalgal photosynthesis?

[J]. Separation and Purification Technology, 2022, 29: 2-15.

[本文引用: 1]

Singh S P, Priyanka S.

Effect of CO2 concentration on algal growth: a review

[J]. Renewable and Sustainable Energy Reviews, 2014, 38: 172-179.

DOI      URL     [本文引用: 1]

Zhu Y, Cheng J, Zhang Z, et al.

Mutation of Arthrospira platensis by gamma irradiation to promote phenol tolerance and CO2 fixation for coal-chemical flue gas reduction

[J]. Journal of CO2 Utilization, 2020, 38(C): 252-261.

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Yang B, Liu J, Ma X, et al.

Genetic engineering of the Calvin cycle toward enhanced photosynthetic CO2 fixation in microalgae

[J]. Biotechnology for Biofuels, 2017, 10(5): 229-241.

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Yong h L, Jay j T, Eric F, et al.

The lipid biochemistry of eukaryotic algae

[J]. Progress in Lipid Research: An International Journal, 2019, 74: 31-68.

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袁莎. 两种富油微藻的选育[D]. 南宁: 广西民族大学, 2017.

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黎秋玲, 李敏, 严志宏, .

富油微藻的筛选及其产油能力的评价

[J]. 微生物学报, 2020, 60(8):1648-1660.

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宋晓金. 富含DHA的裂殖壶菌的工业化生产试验、脂肪酸提取及应用研究[D]. 青岛: 中国海洋大学, 2008.

[本文引用: 1]

李美玉, 李健, 陈萍, .

维生素E和裂壶藻对中国对虾生长及TLR/NF-κB表达水平的影响

[J]. 中国渔业质量与标准, 2012, 2(2):37-44.

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伍先绍, 贺稚非, 龚霄.

杜氏盐藻及其在功能食品中的应用

[J]. 中国食品添加剂, 2008(2):127-130.

[本文引用: 1]

Sun W, Xing L, Lin H, et al.

Assessment and comparison of in vitro immunoregulatory activity of three astaxanthin stereoisomers

[J]. Journal of Ocean University of China, 2016, 15(2): 283-287.

DOI      URL     [本文引用: 1]

梁英, 陈书秀.

微藻育种的研究现状及前景

[J]. 海洋通报, 2008(3):88-94.

[本文引用: 2]

杨小冲, 陈忠军.

新型物理技术在微生物育种中的应用进展

[J]. 食品工业, 2017, 38(3):242-245.

[本文引用: 1]

周玉娇, 李亚军, 费小雯, .

小球藻紫外线诱变及高含油藻株筛选

[J]. 热带作物学报, 2010, 31(12):2124-2129.

[本文引用: 2]

刘红全, 潘艺华, 林小园, .

三角褐指藻紫外线诱变及高产EPA藻株选育

[J]. 海洋科学, 2017, 41(9):87-93.

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李青, 吴洪, 蔡忠贞, .

利用流式细胞仪筛选紫外诱变高含油小球藻

[J]. 中国油脂, 2018, 43(5):110-112.

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孙玲, 刘利平, 徐婉茹, .

物理诱变在药食用菌育种中的应用研究进展

[J]. 安徽农业科学, 2018, 46(14):29-33,153.

[本文引用: 1]

Jiang Y X, Zhu M F, Sun L H, et al.

Study on the effect of 60Co-γ ray irradiation on the stability of vitamin

[J]. Chinese Journal of Health Laboratory Technology, 2010, 20(11): 2796-2798.

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Qi W N, Lu J Y, Zhao J, et al.

Effects of 60Co-γ ray irradiation on protective enzymes isozymes expression in winter wheat

[J]. Journal of Northwest A and F University, 2007, 7(35): 123-126.

[本文引用: 1]

佘隽, 田华, 陈涛, .

高产DHA寇氏隐甲藻突变株的筛选

[J]. 食品科学, 2013, 34(17):230-235.

DOI      [本文引用: 2]

以寇氏隐甲藻ATCC30772(C. cohnii ATCC30772)为出发菌株,经60Co-γ射线辐照诱变,根据生长发育、苏丹黑B染色镜检、生物量、含油率和DHA含量等指标,经初筛、复筛,选出最佳突变株2.4k-2A2-5,其平均DHA含量达到39.04%,比出发株提高了3.39%,油脂产量和含油率比出发株分别提高了51.66%和63.37%,其DHA产量为7.14g/L发酵液,比出发株提高了近56.92%。

马超. 应用60Co-γ射线诱变技术筛选富油微藻藻株[D]. 哈尔滨: 哈尔滨工业大学, 2014.

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Cheng J, Lu H, Huang Y, et al.

Enhancing growth rate and lipid yield of Chlorella with nuclear irradiation under high salt and CO2 stress

[J]. Bioresour Technology, 2016, 203: 220-227.

DOI      URL     [本文引用: 2]

Tanaka A, Shikazono N, Hase Y.

Studies on biological effects of ion beams on lethality, molecular nature of mutation, mutation rate, and spectrum of mutation phenotype for mutation breeding in higher plants

[J]. Journal of Radiation Research, 2010, 51(3): 223-233.

PMID      [本文引用: 1]

Recently, heavy ions or ion beams have been used to generate new mutants or varieties, especially in higher plants. It has been found that ion beams show high relative biological effectiveness (RBE) of growth inhibition, lethality, and so on, but the characteristics of ion beams on mutation have not been clearly elucidated. To understand the effect of ion beams on mutation induction, mutation rates were investigated using visible known Arabidopsis mutant phenotypes, indicating that mutation frequencies induced by carbon ions were 20-fold higher than by electrons. In chrysanthemum and carnation, flower-color and flower-form mutants, which are hardly produced by gamma rays or X rays, were induced by ion beams. Novel mutants and their responsible genes, such as UV-B resistant, serrated petals and sepals, anthocyaninless, etc. were induced by ion beams. These results indicated that the characteristics of ion beams for mutation induction are high mutation frequency and broad mutation spectrum and therefore, efficient induction of novel mutants. On the other hand, PCR and sequencing analyses showed that half of all mutants induced by ion beams possessed large DNA alterations, while the rest had point-like mutations. Both mutations induced by ion beams had a common feature that deletion of several bases were predominantly induced. It is plausible that ion beams induce a limited amount of large and irreparable DNA damage, resulting in production of a null mutation that shows a new mutant phenotype.

刘瑞媛, 金文杰, 曲颖, .

重离子束辐射诱变技术在植物育种中的应用

[J]. 广西科学, 2020, 27(1):20-26.

[本文引用: 1]

Ma Y, Wang Z, Ming Z, et al.

Increased lipid productivity and TAG content in Nannochloropsis by heavy-ion irradiation mutagenesis

[J]. Bioresource Technology, 2013, 136: 360-367.

DOI      URL     [本文引用: 2]

王丽娟, 郑天翔, 杨宋琪, .

12C6+离子束诱变选育温度耐受螺旋藻高产藻株及其培养条件的优化

[J]. 辐射研究与辐射工艺学报, 2020, 38(2):27-34.

[本文引用: 2]

席一梅, 殷亮, 迟占有, .

重离子辐照对盐生杜氏藻的诱变效应及光合响应机理

[J]. 辐射研究与辐射工艺学报, 2020, 38(5):38-45.

[本文引用: 2]

Wang Q, Feng L R, Wei L, et al.

Mutation breeding of lycopene-producing strain Blakeslea trispora by a novel atmospheric and room temperature plasma(ARTP)Applied

[J]. Applied Biochemistry Biotechnology, 2014, 174(1): 452-460.

DOI      URL     [本文引用: 1]

艾江宁, 姚长洪, 孟迎迎, .

生长速度快且油脂产率高的湛江等鞭金藻诱变株的筛选

[J]. 微生物学通报, 2015, 42(1):142-147.

[本文引用: 2]

吴晓英, 柳泽深, 姜悦.

雨生红球藻等离子诱变及高产藻株的筛选

[J]. 食品安全质量检测学报, 2016, 7(9):3781-3787.

[本文引用: 2]

刘秀花, 梁梁, 陈仲达, .

小球藻等离子束诱变高产菌筛选

[J]. 河南科技, 2016(7):122-124.

[本文引用: 2]

和俊豪, 付子琳, 丁军, .

常压室温等离子体诱变选育高产二十二碳六烯酸裂殖壶藻藻株

[J]. 动物营养学报, 2022, 34(7):4750-4760.

DOI      [本文引用: 2]

本试验旨在通过诱变选育得到一株高产二十二碳六烯酸(DHA)的裂殖壶藻藻株,为进一步开发缓解幼龄动物腹泻的新型饲料奠定基础。使用裂殖壶藻原始藻株ATCC20888,通过常压室温等离子体对藻株进行诱变,再进一步通过建立丙二酸、2,2'-联吡啶及丙二酸-2,2'-联吡啶复合筛选方法对诱变藻株进行快速筛选,对筛选突变藻株进行摇瓶发酵,利用磷酸香草醛法和高效气相色谱法对突变藻株的油脂、DHA产量快速检测,得到高产DHA的藻株。结果表明:丙二酸、2,2'-联吡啶及丙二酸-2,2'-联吡啶复合筛选均可以提高裂殖壶藻藻株的平均DHA产量,较原始藻株分别提高了32.20%、25.01%和29.71%。通过丙二酸-2,2'-联吡啶复合筛选得到的诱变藻株I-F-9其DHA含量(54.56%)及产量(10.88 g/L)分别比原始菌株增加了74.62%和61.17%(P<0.05)。由此可见,通过常压室温等离子体诱变选育的裂殖壶藻藻株I-F-9较原始藻株DHA含量及产量均有显著提高,且其DHA产量处于目前同类研究前列。

张瑞成, 李魏, 潘素君, .

化学诱变在种质资源改良上的应用

[J]. 分子植物育种, 2017, 15(12):5189-5196.

[本文引用: 2]

Bhat T A, Wani A A.

Mutagenic effects on meiosis in legumes and a practical case study of Vicia faba L.

[J]. Springer India, 2017, 10(11): 219-244.

[本文引用: 2]

孙中贯, 刘咏, 姚建铭, .

高产二十二碳六烯酸隐甲藻的选育及其发酵条件研究

[J]. 食品科学, 2013, 34(5):202-206.

DOI      [本文引用: 3]

利用亚硝基胍对隐甲藻ATCC30556进行诱变处理,通过30℃高温培养初筛及摇瓶发酵复筛,得到二十二碳六烯酸(DHA)产量稳定提高的突变株LS1057,其DHA占总脂肪酸的含量从出发株的25.78%提高到32.02%。研究摇瓶发酵条件对突变株发酵的影响,结果表明:在初始pH6.5、温度26℃、转速150r/min的发酵条件下培养216h后,其生物量、总油脂产量及DHA产量分别达到14.06、3.14g/L和1.057g/L,分别比出发藻株提高了21.31%、69.73%和121.59%。

Xie B, Stessman D, Hart J H, et al.

High-throughput fluorescence-activated cell sorting for lipid hyperaccumulating Chlamydomonas reinhardtii mutants

[J]. Plant Biotechnology Journal, 2014, 12(7): 872-882.

DOI      PMID      [本文引用: 3]

The genetically tractable microalga Chlamydomonas reinhardtii has many advantages as a model for renewable bioproducts and/or biofuels production. However, one limitation of C. reinhardtii is its relatively low-lipid content compared with some other algal species. To overcome this limitation, we combined ethane methyl sulfonate mutagenesis with fluorescence-activated cell sorting (FACS) of cells stained with the lipophilic stain Nile Red to isolate lipid hyperaccumulating mutants of C. reinhardtii. By manipulating the FACS gates, we sorted mutagenized cells with extremely high Nile Red fluorescence signals that were rarely detected in nonmutagenized populations. This strategy successfully isolated several putative lipid hyperaccumulating mutants exhibiting 23% to 58% (dry weight basis) higher fatty acid contents than their progenitor strains. Significantly, for most mutants, nitrogen starvation was not required to attain high-lipid content nor was there a requirement for a deficiency in starch accumulation. Microscopy of Nile Red stained cells revealed that some mutants exhibit an increase in the number of lipid bodies, which correlated with TLC analysis of triacyglycerol content. Increased lipid content could also arise through increased biomass production. Collectively, our findings highlight the ability to enhance intracellular lipid accumulation in algae using random mutagenesis in conjunction with a robust FACS and lipid yield verification regime. Our lipid hyperaccumulating mutants could serve as a genetic resource for stacking additional desirable traits to further increase lipid production and for identifying genes contributing to lipid hyperaccumulation, without lengthy lipid-induction periods. © 2014 Society for Experimental Biology, Association of Applied Biologists and John Wiley & Sons Ltd.

沈国明, 牛健康, 陆开形, .

雨生红球藻诱变后生长速率和超微结构的变化

[J]. 核农学报, 2015, 29(4):623-628.

DOI      [本文引用: 2]

为探讨亚硝基胍(N-methyl-N'-Nitro-N-Nitrosoguanidine, NTG)对雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)生长速率及超微结构变化的影响, 用不同浓度的NTG处理藻类, 对藻类的生长速率、色素含量和超微结构的变化进行了研究.结果表明:即使低浓度(0.5 g&middot;L<sup>-1</sup>)的NTG对雨生红球藻也是致死的, 致死率与NTG 浓度呈正相关.藻类经中等浓度(2.5 g&middot;L<sup>-1</sup>)NTG诱变后, 存活藻类的增长速率K值和虾青素含量分别达到 0.381&plusmn;0.0289 和 2.9&plusmn;0.29 mg&middot;L<sup>-1</sup>.低浓度NTG处理藻类其叶绿素含量略有上升, 但高浓度(3.5 g&middot;L<sup>-1</sup>)时叶绿素含量明显减少.低NTG浓度处理时藻类细胞结构变化不大, 但高浓度处理时细胞膜、线粒体及叶绿体等均遭受不同程度的损伤.本研究可为深入理解NTG诱变藻类的生理生化机制提供借鉴.

Zhang Y, He M, Zou S, et al.

Breeding of high biomass and lipid producing Desmodesmus sp.by Ethylmethane sulfonate-induced mutation

[J]. Bioresource Technology, 2016, 207: 268-275.

DOI      PMID      [本文引用: 2]

To improve the biomass yield and lipid productivity, two desert microalgae, Desmodesmus sp. S81 and G41 were induced mutagenesis by Ethylmethane sulfonate (EMS), and obtained two potential mutants, Desmodesmus sp. S5 and G3 from the mutagenic clones for their greatly promoted biomass and lipid production. The results showed that the biomass yield, lipid content and lipid productivity of the mutant strains S5 and G3 were 778.10mg·L(-1), 48.41% and 19.83mg·L(-1)·d(-1), 739.52mg·L(-1), 46.01%, and 17.92mg·L(-1)·d(-1), respectively, which presented the increment of 45.50%, 8.00% and 74.24%, 20.67%, 10.35% and 55.77% than those of S81 and G41. Comparing with the wild strains, the mutants showed reduced PUFAs and glycol lipids, elevated MUFAs and neutral lipids contents, which were appropriate for biodiesel production. Copyright © 2016 Elsevier Ltd. All rights reserved.

徐晓莹, 黄华, 陈坤, .

雨生红球藻藻种改良趋势及育种研究进展

[J]. 水产学杂志, 2021, 34(5):100-103.

[本文引用: 1]

You L, Jouhet J, Maréchal E, et al.

Acyl-CoA: lysophosphatidylcholine acyltransferase from the unicellular diatom Phaeodactylum tricornutum (PtLPCAT1) is involved in triacylglycerol and galactoglycerolipid synthesis and enhances eicosapentaenoic acid accumulation in recombinant oleaginous yeast

[J]. Plant Biotechnology Journal, 2023, 21(2): 238-240.

DOI      URL     [本文引用: 3]

Niu Y F, Zhang M H, Li D W, et al.

Improvement of neutral lipid and polyunsaturated fatty acid biosynthesis by overexpressing a type 2 diacylglycerol acyltransferase in marine diatom Phaeodactylum tricornutum

[J]. Marine Drugs, 2013, 11(11):4558-4569.

DOI      URL     [本文引用: 2]

Balamurugan S, Wang X, Wang H L, et al.

Occurrence of plastidial triacylglycerol synthesis and the potential regulatory role of AGPAT in the model diatom Phaeodactylum tricornutum

[J]. Biotechnology for Biofuels, 2017, 10(1): 97.

DOI      URL     [本文引用: 2]

Zou L G, Chem J W, Zheng D L, et al.

High-efficiency promoter-driven regulation of multiple metabolic nodes elevates lipid accumulation in the mode microalgae Phaeodactulum tricornutum

[J]. Microbial Cell Factories, 2018, 17(1): 54.

DOI      [本文引用: 2]

Hao X, Luo L, Jouhet J, et al.

Enhanced triacylglycerol production in the diatom Phaeodactylum tricornutum by inactivation of a hotdog-fold thioesterase gene using TALEN-based targeted mutagenesis

[J]. Biotechnology Biofuels. 2018, 11: 1-18.

DOI      URL     [本文引用: 2]

胡小文, 马帅, 付莉莉, .

紫外诱变热带微藻选育高油脂藻株

[J]. 热带农业科学, 2011, 31(7):25-28.

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Ke C, Guan W, Bu S, et al.

Determination of absorption dose in chemical mutagenesis in plants

[J]. PLoS One, 2019, 14(1): e0210596.

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