四环素类药物作为广谱抗生素,因其价格便宜,目前仍被广泛应用于畜禽、水生生物等产业领域,但若不合理地使用该类药物,导致在动物源性食品中的残留,会对消费者产生毒副作用[1-2],因此开展四环素类药物残留的分析和监测研究工作对于保护人类健康及环境有一定的帮助。为保障食品安全和人类健康,我国三部委联合发布的食品安全国家标准GB 31650—2019《食品中兽药最大残留限量》[3]中规定,四环素(Tetracycline,TC)、金霉素(Chlorotetracycline,CTC)每日允许摄入量为0~30 μg/kg,二者在鱼肉中单个或组合的最大残留限量为200 μg/kg;多西环素(Doxycycline hyclate,DTC)每日允许摄入量为0~3 μg/kg,在鱼肉中最大残留限量为100 μg/kg。
通过对四环素类药物理化性质的研究,已经建立了多种检测四环素类药物残留的分析方法[4⇓-6],主要有荧光法、紫外分光光度法、质谱法和化学发光法等。质谱法具有精密度高、可同时进行多种药物检测等优点,但是也存在仪器昂贵、检测成本较高等不足。紫外分光光度法方法比较简单,但是存在检测灵敏度低、基质杂质干扰大等问题;在一定pH值范围内,四环素类抗生素及其部分衍生物能产生荧光,并且一些螯合物的荧光强度比四环素类抗生素强,因此其可用于荧光检测。目前利用四环素类天然荧光进行的检测因灵敏度较低而较少被采用,多对其进行与金属离子的络合衍生,从而显著提高检测灵敏度,但是其需进行柱前衍生,且对pH等条件要求较高[7]。化学发光分析法[8-9]因便于操作、分析快速、灵敏度高、线性范围宽等显著优点而受到青睐,其中近年来纳米二氧化钛(nano TiO2)因光致强氧化性而受到关注[10-11]。
目前纳米TiO2的光催化氧化还原性质较少被应用于化学检测领域,因此本文尝试利用具有光致强氧化性且价廉环保的纳米TiO2代替传统的化学发光氧化试剂,对四环素类药物进行检测,以TC、CTC和DTC为分析对象,进行光催化条件的优化,并应用于实际样品的检测,以期满足低成本环保检测要求。
1 材料与方法
1.1 主要仪器
岛津LC-20AD高效液相色谱仪,配有LC-20AD色谱泵(日本岛津公司);低压汞灯(253.7 nm,40 W,浙江新源照明电器公司);镀有纳米TiO2的玻璃纤维(0.3 mm O.D.)固定在石英管中(150 mm × 0.8 mm I.D.),6根石英管相互连接,使之平行环绕于低压汞灯,并以铝箔包裹,以充分利用紫外光(图1a);IFFL-E流动注射化学发光分析仪(西安瑞迈分析仪器有限公司);SX3-4-10A型纤维电阻炉(天津中环实验电炉有限公司);AB204-E电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司);Milli-Q Academic去离子水发生器(上海百微生物科技有限公司)。
1.2 主要试剂
盐酸四环素、盐酸金霉素和盐酸多西环素对照品,纯度≥95%,上海生物工程技术服务有限公司;甲醇(色谱纯)﹑乙腈(色谱纯),美国Merck公司;亚铁(分析纯),国药集团化学试剂有限公司,溶液临用前配制并通氮气除氧;鲁米诺,纯度为97%,美国Sigma公司;8~10 nm锐钛型TiO2,上海江沪钛白有限公司;其余试剂皆为分析纯,购于国药集团化学试剂有限公司;所用水为超纯水。
1.3 方法
1.3.1 标准溶液配制
标准储备液:精密称取盐酸四环素、盐酸金霉素和盐酸多西环素对照品各10 mg,分别置于10 mL棕色量瓶中,用甲醇溶解并定容,配制成1 mg/mL的标准储备液(避光保存);精密量取各储备液适量,用甲醇稀释至浓度分别为100 μg/mL、10 μg/mL的混合标准工作液,临用前现配。
1.3.2 样品采集与制备
实验草鱼样品来自当地市场,经检测,无药物残留。将草鱼去头、骨、内脏,取肌肉、鱼皮等可食部分均质匀浆,置于-20℃冷冻保存备用。
1.3.3 样品前处理
称取试样(5±0.05)g置于50 mL离心管中,加入乙酸乙酯10 mL,涡旋1 min,中速振荡10 min,5 000 r/min离心5 min,收集上清液;下层再用10 mL乙酸乙酯重复提取1次;合并提取液,于40°C水浴旋蒸至干。加1 mL 0.01 mol/L稀盐酸溶液溶解残留物,再加入2 mL正己烷涡旋混匀,以4 000 r/min离心3 min,取下层液,经0.45 μm滤膜过滤,上机测定。
1.3.4 色谱条件
色谱柱:Shimadzu VP-ODS C18柱(250 mm×2.0 mm,粒径5 μm);流动相:乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钠溶液(氨水调节至pH 2.6)(30∶70,V/V);流速0.2 mL/min;柱温:25℃;进样量100 μL。
1.3.5 TiO2涂层的制作方法
1.3.6 检测流程
新配制的0.3 mg/L亚铁溶液以0.8 mL/min流速和色谱分离后的TCs样品混合,流经TiO2光反应器的0.625‰甲酸溶液和3×10-4 mol/L鲁米诺(pH=10.0)形成的混合液与TCs样品混合后,所产生的化学发光信号被化学发光分析仪检测,流程图见图1b。
图1
图1
UV-TiO2光催化反应器(a)和四环素类抗生素检测的流程图(b)
Fig.1
Schematic diagrams of UV-TiO2 photocatalytic reactor (a) and flow diagram of TCs (b)
1.3.7 标准曲线的制备
精密量取适宜浓度的四环素类标准工作液,用水稀释成浓度为0.5、1、2、5、10、20和50 mg/L的系列标准溶液,从低浓度到高浓度依次进样,供仪器测定。以测得的峰面积为纵坐标、对应的标准溶液浓度为横坐标、绘制标准曲线,并计算回归方程和线性相关系数。
1.3.8 方法灵敏度、准确度及精密度的测定
按1.3.4项样品前处理方法处理样品,再按1.3.5项液相色谱条件和1.3.7项检测流程进行分析测定。以信噪比S/N≥3为检测限、S/N≥10为定量限。取空白鱼肉样品,添加3个不同浓度(定量限、500 μg/kg、1 000 μg/kg)混合标准工作液。每个浓度5个样品平行实验,重复3次,按照样品前处理方法处理后,上机测定,计算回收率、批内和批间变异系数。
2 结果与分析
2.1 标准曲线及线性范围
图2
图2
四环素类抗生素鱼肉空白样品色谱图(a)和加标后色谱分离图(b)
Fig.2
Typical chromatograms of a blank sample of fish (a), fish with addition of TCs (b)
表1 HPLC-nano TiO2-CL体系用于四环素类抗生素的分析参数
Tab.1
| 化合物Compounds | 线性范围/(mg/L) Linear range | 回归方程Regression equation | 相关系数(R2)Correlation coefficient |
|---|---|---|---|
| 四环素TC | 0.5~50 | Y=0.423 8x+1.635 | 0.991 3 |
| 金霉素CTC | 0.5~50 | Y=0.156 8x+0.416 8 | 0.995 6 |
| 多西环素DTC | 0.5~50 | Y=0.648 8x+4.268 8 | 0.992 1 |
2.2 方法灵敏度、准确度及精密度
按照1.3.4中所述方法进行处理,空白鱼肉中TC、CTC、DTC定量限分别为10.0、30.0和10.0 μg/kg。HPLC-nano TiO2-CL体系应用于检测鱼肉中四环素类药物,计算的回收率及分析结果如表2所示。
表2 四环素类抗生素在鱼肉样品中的回收率(n=5)
Tab.2
| 分析物 Compounds | 添加浓度 /(mg/kg) Added concentration | 平均回收率/% Average recovery | 批内变异系数/% Coefficient of variation of intra-assay | 批间变异系数/% Coefficient of variation of inter-assay | 定量限 /(mg/kg) LOQ |
|---|---|---|---|---|---|
| 四环素TC | 10.0 | 72.6 | 5.4 | 12.7 | 10.0 |
| 500 | 83.2 | 6.0 | |||
| 1 000 | 95.6 | 5.7 | |||
| 金霉素CTC | 30.0 | 73.7 | 5.9 | 10.6 | 30.0 |
| 500 | 77.0 | 6.0 | |||
| 1 000 | 89.4 | 7.0 | |||
| 多西环素DTC | 10.0 | 77.3 | 7.1 | 14.7 | 10.0 |
| 500 | 95.4 | 5.3 | |||
| 1 000 | 107 | 5.1 |
3 讨论与结论
3.1 检测条件的优化
3.1.1 光催化条件的优化
为提高检测灵敏度,从优化化学发光反应条件和光催化两个方面进行考察。在光催化条件下,缓冲溶液对于获得稳定可靠的化学发光信号有一定的影响。本实验对不同缓冲溶液(碳酸盐、硼酸盐和磷酸盐)进行了考察,以磷酸盐为缓冲溶液时,可获得最佳化学发光信号和信噪比,可能机理是相对于碳酸盐等其他缓冲盐,在紫外光照过程中磷酸根与OH·结合速率较低[14],导致溶液中存在相对多的活跃自由基,造成氧化性相对较强。本文对磷酸盐缓冲溶液的浓度也进行了考察,当磷酸盐浓度范围为0.05~0.8 mol/L时,随着磷酸盐浓度增加,TC化学发光的信号升高,但其浓度过高会使基线波动较大,因此磷酸盐的浓度选择0.2 mol/L。考察磷酸盐缓冲溶液在pH值6.0~10.0范围内对实验的影响,当pH为8.0~9.0之间时,化学发光信号最强且比较稳定,因此本实验中所选磷酸盐缓冲溶液的pH为8.2。
图3
图3
甲酸对化学发光信号的影响
Fig.3
Effect of formic acid on the decreased CL relative intensity
本研究也对混合管的长度(0~5 m)进行了考察,通过考察可知,化学发光信号随着混合管长度的增加而增强,为同时获得最佳化学发光信号和最佳分离度,最终所选择混合管路的长度为2 m。
3.1.2 化学发光条件的优化
已知一些过渡金属离子会对鲁米诺化学发光反应具有催化作用,本实验Fe3+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Zn2+均对化学发光信号具有增强作用,Fe2+对化学发光增强效果较好,由已知文献报道可推测Fe2+与TiO2光催化甲酸溶液生成的H2O2快速反应,生成具有强氧化性的OH·,OH·再与H2O2反应生成超氧化物[16],从而氧化鲁米诺生成3-氨基邻苯二甲酸盐,产生强烈的化学发光信号,而且Fe2+与四环素类药物的络合常数仅低于Fe3+与四环素的络合常数[17],因此本实验选择Fe2+。考察Fe2+浓度对化学发光信号的影响,当Fe2+浓度低于0.3 mg/L时,基线较低造成信号响应变差;当Fe2+浓度高于0.35 mg/L时,随着浓度增加,信号逐渐降低;当在Fe2+溶液中加入1.0 mol/L NaCl时,信号有一定增强,可能是NaCl增强了溶液的离子强度,有利于反应向金属离子和TC络合方向进行[18]。
本文还研究了鲁米诺浓度及其pH值对四环素化学发光检测信号的影响,随着鲁米诺浓度增强,信号逐渐增强,当鲁米诺浓度高于3×10-4 mol/L时,其信号不再增强且化学发光的信号较不稳定,因此选择的鲁米诺浓度为3×10-4 mol/L。在此条件下,鲁米诺最佳pH为10.0,当pH大于11.0时信号降低。
3.2 色谱分离条件的优化
流动相组成的选择是获得良好的色谱峰形和最佳化学发光信号的关键因素。四环素类药物在弱酸条件下比较稳定,为避免四环素类药物与金属离子的螯合和硅羟基的作用,选择缓冲溶液为磷酸二氢盐,流动相pH为2.6。有机溶剂的比例对化学发光信号也有一定的影响,乙腈的比例高于30%会对化学发光的信号产生比较强的淬灭作用;但是当乙腈的比例较低时,色谱分离时间变长,而且色谱峰形变宽甚至重叠,因此选择的乙腈比例为30%。
3.3 可能的机理
TiO2在紫外光催化产生的空穴与溶液中的H2O和OH-反应生成活性氧,如超氧阴离子(O2-)和过氧化氢(H2O2)等,如以下化学反应式:
由此可知,背景信号的产生来自于紫外光照TiO2产生的活性氧如H2O2等、氧化鲁米诺产生的化学发光;当甲酸引入TiO2体系时,光生空穴氧化吸附于其表面的甲酸有更多的活性氧生成[14],因而造成化学发光背景信号增强。Fe2+与TiO2光催化产生的活性氧快速反应,生成氧化性更强的·OH,从而具有较强的催化作用,而四环素类药物与Fe2+形成络合物,造成化学发光信号降低,降低量与四环素类药物浓度成比例,进而对四环素类药物进行定量检测。
本方法联用色谱和化学发光,实现同时分离检测四环素类药物,首先其灵敏度可满足生物样品如鱼肉中四环素类药物的检测要求;其次此法成本较低;最后减少了化学试剂的使用,从而避免对环境的污染,为试剂开发提供了一种思路,同时为动物源食品中四环素类药物检测建立了新的方法。
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图1
表1
